安益譜TQ9100液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)測(cè)定人血清中睪酮、雄烯二酮等激素含量
引言
多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS），是由遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，高發(fā)年齡為20～35歲，育齡女性PCOS患病率為5%～10%。其主要的臨床表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕、高雄激素血癥、卵巢多囊，可伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂紊亂等代謝異常，并可導(dǎo)致2型糖尿病、心腦血管疾病和子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。目前，PCOS病理生理的核心問題是高雄激素血癥已成為學(xué)科領(lǐng)域內(nèi)專家的共識(shí)。高雄激素血癥指女性體內(nèi)雄激素水平升高或功能過強(qiáng)，一般通過臨床表現(xiàn)或生化檢測(cè)來評(píng)估雄激素的升高程度。高雄激素的臨床表現(xiàn)主要為多毛、痤瘡、脫發(fā)和男性化體征；生化檢測(cè)指標(biāo)主要為總睪酮（total testosterone，TT）、游離睪酮（free testosterone，F(xiàn)T）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、硫酸脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S）、4-雄烯二酮（4-androstenedione，A4）。2018年發(fā)布的《多囊卵巢綜合征中國(guó)診療指南》建議：對(duì)于育齡期、圍絕經(jīng)期、青春期女性，應(yīng)先進(jìn)行高雄激素血癥評(píng)估，并逐一排除其他可能引起高雄激素和排卵障礙的疾病，才能明確PCOS診斷。
檢測(cè)患者體內(nèi)總睪酮水平是臨床評(píng)估女性雄激素升高的首要方法，血清游離睪酮水平升高則是診斷高雄激素血癥的最佳指標(biāo)。2023年發(fā)布的《多囊卵巢綜合征雄性激素質(zhì)譜檢測(cè)專家共識(shí)》建議使用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定患者體內(nèi)血清總睪酮和雄烯二酮含量，再通過計(jì)算得到游離睪酮指數(shù)FAI，可以有效預(yù)測(cè)PCOS患者代謝風(fēng)險(xiǎn)，提高對(duì)高雄激素血癥的篩查效率。因此本方法利用ANYEEP TQ9100液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)人血清中的睪酮、雄烯二酮等雄激素以及孕酮和17α-羥孕酮等孕激素。
實(shí)驗(yàn)部分
樣品處理：取待測(cè)樣本200μL于1.5mL EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL，再加入甲基叔丁基醚980μL；渦旋混勻（2500rpm，10min）并離心（4℃，14000rpm，10min）；取上清液800μL于96孔板中，45℃氮吹至干；在吹干的96孔板中加入160μL復(fù)溶液（50%甲醇），置于微孔板震蕩儀上2000rpm/min震搖2min，4000rpm離心5min，5μL進(jìn)樣。
色譜條件：色譜柱使用Waters BEH C18 2.1mm × 50mm 1.7μm進(jìn)行液相分離，流動(dòng)相A為水（含0.2mM氟化銨），流動(dòng)相B為甲醇（含0.2mM氟化銨），柱溫40℃，梯度設(shè)置見表1。
質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化源正離子模式（ESI+）和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行質(zhì)譜掃描。離子化源溫度500℃，噴霧電壓5000V，氣簾氣20psi，霧化氣為50psi，輔助加熱氣為50psi，碰撞氣8，EP 7.5V，CXP 0V。各化合物離子對(duì)參數(shù)見表2。
表1 梯度洗脫條件
時(shí)間 | 流速 | A相 | B相 |
min | mL/min | % | % |
0 | 0.4 | 85 | 15 |
1.0 | 0.4 | 40 | 60 |
3.0 | 0.4 | 5 | 95 |
4.0 | 0.4 | 5 | 95 |
4.1 | 0.4 | 85 | 15 |
5.5 | 0.4 | 85 | 15 |
表2 待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)MRM離子對(duì)參數(shù)
待測(cè)物名稱 | Q1離子 | Q3離子 | 駐留時(shí)間 ms | CE (V) | DP (V) |
雄烯二酮* | 287.2 | 97.0 | 25 | 12 | 100 |
雄烯二酮 | 287.2 | 109.0 | 25 | 15 | 100 |
睪酮* | 289.2 | 97.0 | 25 | 12 | 100 |
睪酮 | 289.2 | 109.0 | 25 | 15 | 100 |
17α-羥孕酮* | 331.2 | 97.0 | 25 | 12 | 100 |
17α-羥孕酮 | 331.2 | 109.0 | 25 | 15 | 100 |
黃體酮* | 315.2 | 97.0 | 25 | 12 | 100 |
黃體酮 | 315.2 | 109.0 | 25 | 15 | 100 |
雄烯二酮-d7* | 361 | 100.0 | 25 | 12 | 100 |
雄烯二酮-d7 | 294.2 | 331.2 | 25 | 15 | 100 |
睪酮-d3* | 294.2 | 97.0 | 25 | 16 | 100 |
睪酮-d3 | 292.2 | 113.0 | 25 | 12 | 100 |
17α-羥孕酮-d8* | 292.2 | 100.0 | 25 | 12 | 100 |
17α-羥孕酮-d8 | 339.2 | 109.0 | 25 | 16 | 100 |
黃體酮-d9* | 339.2 | 100.0 | 25 | 12 | 100 |
黃體酮-d9 | 324.1 | 109.0 | 25 | 16 | 100 |
*為定量離子對(duì)
結(jié)果與討論
4種激素的提取離子圖見圖1，保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程（權(quán)重1/x2）、精密度（以RSD%計(jì)）和準(zhǔn)確度（以回收率%計(jì)）見表3。
從表中可見，回歸方程r2均大于0.998（即r大于0.999），低濃度、中濃度和高濃度的精密度（RSD%）均小于10%，回收率在92.2%~105.4%之間。
表3 脂溶性維生素保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果
圖1 4種激素基質(zhì)加標(biāo)LLOQ提取離子圖
從上到下依次為雄烯二酮、睪酮、17α羥孕酮和孕酮
總結(jié)
本方法使用安益譜全自主研發(fā)生產(chǎn)的TQ 9100三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，可同時(shí)檢測(cè)血清中睪酮、雄烯二酮、孕酮和17α-羥孕酮的含量，該方法線性好、準(zhǔn)確度高，前處理簡(jiǎn)單，單個(gè)樣本分析時(shí)間為5.5分鐘，通量較高，適合臨床使用。
