安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀測定人血漿中 15 種膽汁酸含量的方法研究
摘要
本研究建立了一種基于安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）測定人血漿中 15 種膽汁酸含量的分析方法，旨在為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療及病理機制研究提供準確、可靠的檢測技術(shù)支撐。通過優(yōu)化樣品前處理方法、色譜分離條件及質(zhì)譜檢測參數(shù)，對方法的專屬性、線性范圍、精密度、準確度、基質(zhì)效應、穩(wěn)定性等進行系統(tǒng)驗證。結(jié)果表明，15 種膽汁酸在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2 均大于 0.998），日內(nèi)和日間精密度相對標準偏差（RSD）均小于 8%，準確度在 85%-115% 之間，基質(zhì)效應影響較小，且樣品在不同儲存條件下穩(wěn)定性良好。該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強、重復性好，可滿足人血漿中 15 種膽汁酸同時定量檢測的需求，為臨床實驗室開展膽汁酸相關(guān)檢測項目及科研工作提供了有效的技術(shù)手段。
安益譜TQ9100三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀
目前，用于測定生物樣本中膽汁酸的分析方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）及液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）等 [5]。HPLC 法雖操作相對簡便，但靈敏度較低，且難以實現(xiàn)多種膽汁酸的同時分離與定量；GC-MS 法需要對膽汁酸進行衍生化處理，操作繁瑣、耗時較長，且衍生化過程可能引入誤差；而 LC-MS/MS 法具有靈敏度高、特異性強、分辨率高、分析速度快及可實現(xiàn)多組分同時檢測等優(yōu)勢，已成為生物樣本中膽汁酸定量分析的首選方法 [6-7]。
安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀是一款性能優(yōu)異的分析儀器，具備高靈敏度、高穩(wěn)定性及良好的重現(xiàn)性，在生物樣本分析領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。本研究旨在利用該儀器，建立一種可同時測定人血漿中 15 種膽汁酸（包括游離型膽汁酸：膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸；結(jié)合型膽汁酸：甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸、牛磺石膽酸、牛磺熊脫氧膽酸）含量的 LC-MS/MS 方法，并對方法進行全面驗證，以期為臨床及科研工作提供可靠的檢測方法。
實驗部分
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器
安益譜 TQ9100 三重四極桿液相質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源（ESI））
2.1.2 試劑與耗材
15 種膽汁酸標準品（膽酸（CA）、鵝脫氧膽酸（CDCA）、脫氧膽酸（DCA）、石膽酸（LCA）、熊脫氧膽酸（UDCA）、甘氨膽酸（GCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（GDCA）、甘氨石膽酸（GLCA）、甘氨熊脫氧膽酸（GUDCA）、牛磺膽酸（TCA）、牛磺鵝脫氧膽酸（TCDCA）、牛磺脫氧膽酸（TDCA）、牛磺石膽酸（TLCA）、牛磺熊脫氧膽酸（TUDCA），純度均≥98%，美國 Sigma-Aldrich 公司）；氘代內(nèi)標（膽酸 - d4（CA-d4）、甘氨膽酸 - d4（GCA-d4）、牛磺膽酸 - d4（TCA-d4），純度均≥98%，美國 C/D/N Isotopes 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國 Thermo Fisher Scientific 公司）； ammonium acetate（分析純，中國國藥集團化學試劑有限公司）；超純水（18.2 MΩ?cm）；固相萃取柱（Oasis HLB，30 mg/1 mL，美國 Waters 公司）；人血漿樣本（來源于健康志愿者，經(jīng)倫理委員會批準，志愿者知情同意）。
2.2 實驗方法
2.2.1 標準溶液的配制
分別精密稱取 15 種膽汁酸標準品適量，用甲醇溶解并定容，配制濃度為 1.0 mg/mL 的單組分標準儲備液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用時，取各單組分標準儲備液適量，用甲醇稀釋成濃度為 10.0 μg/mL 的混合標準中間液。再根據(jù)需要，用空白血漿（經(jīng)處理后不含待測膽汁酸的人血漿）稀釋混合標準中間液，配制得到一系列濃度的混合標準工作溶液，用于繪制標準曲線。
精密稱取氘代內(nèi)標（CA-d4、GCA-d4、TCA-d4）適量，用甲醇溶解并定容，配制濃度為 1.0 mg/mL 的內(nèi)標儲備液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用時，用甲醇稀釋內(nèi)標儲備液，得到濃度為 1.0 μg/mL 的內(nèi)標工作溶液。
2.2.2 樣品前處理
取人血漿樣本 50 μL，置于 1.5 mL 離心管中，加入內(nèi)標工作溶液 10 μL，渦旋混勻 1 min；隨后加入甲醇 150 μL，渦旋振蕩 2 min，以沉淀蛋白質(zhì)；將離心管置于高速離心機中，在 4℃、12000 r/min 條件下離心 10 min，吸取上清液置于另一干凈的離心管中；向沉淀中再次加入甲醇 100 μL，渦旋振蕩 1 min，4℃、12000 r/min 離心 8 min，合并兩次上清液；將合并后的上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（預先用 500 μL 甲醇活化，再用 500 μL 超純水平衡）中，依次用 500 μL 超純水和 500 μL 5% 甲醇水溶液洗脫雜質(zhì)，最后用 500 μL 90% 甲醇水溶液洗脫待測組分，收集洗脫液；將洗脫液置于氮吹儀中，在 40℃條件下氮氣吹干；加入流動相（甲醇 - 0.1% 甲酸水溶液，體積比為 60:40）100 μL 復溶，渦旋振蕩 1 min，4℃、12000 r/min 離心 5 min，取上清液，待測。
2.2.3 色譜條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35℃；進樣量：5 μL；流動相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液，B 相為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：0-2 min，B 相 30%；2-8 min，B 相 30%-80%；8-12 min，B 相 80%-95%；12-15 min，B 相 95%；15-15.1 min，B 相 95%-30%；15.1-20 min，B 相 30%；流速：0.3 mL/min。
2.2.4 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI），負離子掃描模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：500℃；霧化氣壓力（GS1）：50 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；碰撞氣壓力（CAD）：Medium。15 種膽汁酸及內(nèi)標的 MRM 參數(shù)（包括母離子、子離子、碰撞能量、去簇電壓等）通過直接注入標準品溶液進行優(yōu)化確定，具體參數(shù)見表 1（此處省略表格，實際論文中需詳細列出每種物質(zhì)的參數(shù)）。
2.3 方法驗證
按照《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》（中國藥典 2020 年版四部通則 9012）及相關(guān)國際規(guī)范，對建立的方法進行專屬性、線性范圍、精密度、準確度、基質(zhì)效應、穩(wěn)定性等方面的驗證。
2.3.1 專屬性
取空白血漿、空白血漿添加 15 種膽汁酸標準品及內(nèi)標、健康人血漿樣本，按照上述樣品前處理方法處理后，進行 LC-MS/MS 分析，記錄色譜圖，考察空白血漿中的雜質(zhì)是否對待測膽汁酸及內(nèi)標的檢測產(chǎn)生干擾。
2.3.2 線性范圍
取混合標準工作溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進行分析，以各膽汁酸的濃度（x，ng/mL）為橫坐標，其對應的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（y）為縱坐標，采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)為 1/x2）進行線性回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），確定各膽汁酸的線性范圍。
2.3.3 精密度
選取低、中、高三個濃度水平（分別為線性范圍的低限附近、中間濃度、高限附近）的混合標準工作溶液，每個濃度水平平行制備 6 份樣品，按照上述方法進行分析，計算日內(nèi)精密度（RSD）；連續(xù) 3 天，每天對每個濃度水平平行制備 6 份樣品進行分析，計算日間精密度（RSD）。
2.3.4 準確度
采用加標回收實驗進行準確度驗證。選取空白血漿，分別添加低、中、高三個濃度水平的 15 種膽汁酸標準品，每個濃度水平平行制備 3 份樣品，按照上述樣品前處理方法處理后進行 LC-MS/MS 分析，計算回收率，回收率在 85%-115% 之間視為準確度合格。
2.3.5 基質(zhì)效應
分別取 6 份不同來源的空白血漿，按照上述樣品前處理方法處理后，加入一定濃度的 15 種膽汁酸標準品及內(nèi)標，得到基質(zhì)匹配標準溶液；同時，用流動相配制相同濃度的標準溶液（不含基質(zhì)）。將兩種溶液按照上述色譜和質(zhì)譜條件進行分析，計算基質(zhì)匹配標準溶液中各膽汁酸峰面積與流動相配制標準溶液中對應峰面積的比值，若比值在 80%-120% 之間，表明基質(zhì)效應影響較小。
2.3.6 穩(wěn)定性
選取低、中、高三個濃度水平的加標血漿樣品，分別考察其在室溫條件下放置 4 h（室溫穩(wěn)定性）、4℃冰箱中放置 24 h（冷藏穩(wěn)定性）、-20℃冰箱中冷凍保存 30 天（冷凍穩(wěn)定性）及經(jīng)過 3 次凍融循環(huán)（凍融穩(wěn)定性）后的穩(wěn)定性。每個條件下平行制備 3 份樣品，按照上述方法進行分析，計算各膽汁酸的測定濃度與理論濃度的比值，若比值在 85%-115% 之間，表明樣品在該條件下穩(wěn)定性良好。
