ANYEEP TQ9100 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)在人血清脂溶性維生素檢測中的應用
技術博客 | 2025-09-18 | 閱讀
維生素作為人體必需的微量有機化合物，其缺乏往往呈現(xiàn)進行性發(fā)展特征，早期亞臨床缺乏階段臨床表現(xiàn)隱匿，易被忽視。但長期缺乏會引發(fā)一系列特征性健康問題：維生素 A（VA）缺乏可導致夜盲癥，影響視覺功能；維生素 D（以 25 - 羥基維生素 D2、25 - 羥基維生素 D3 為主要活性形式）缺乏會干擾鈣磷代謝，阻礙骨骼正常發(fā)育；維生素 E（VE）缺乏可能導致生育功能異常；維生素 K（VK1）缺乏則會破壞凝血機制，增加出血風險。
在臨床診療與健康管理中，精準的維生素檢測是評估人體營養(yǎng)狀態(tài)、指導個性化營養(yǎng)補充的關鍵依據(jù)，尤其適用于嬰幼兒、孕產(chǎn)婦、老年人及慢性疾病患者等特定人群的營養(yǎng)監(jiān)測。傳統(tǒng)檢測方法常受限于單一離子源適配性、檢測效率低等問題，難以滿足多類脂溶性維生素同時精準分析的需求。
ANYEEP TQ9100 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)憑借其獨特的技術設計，可同時支持電噴霧離子化源（ESI）與大氣壓化學電離源（APCI），無需切換離子化源或變更色譜條件，即可實現(xiàn)人血清中 VA、25 - 羥基維生素 D2（25OHVD2）、25 - 羥基維生素 D3（25OHVD3）、VE、VK1 五種脂溶性維生素的同步檢測，為臨床提供高效、精準的檢測方案。
安益譜TQ9100三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀
樣品處理是確保檢測準確性的基礎環(huán)節(jié)，本實驗采用高效且穩(wěn)定的前處理步驟，具體如下：
- 取樣與加樣：精確吸取 200μL 待測人血清樣本至 1.5mL EP 管中，加入 20μL 內(nèi)標溶液以校正檢測偏差，再加入 400μL 異丙醇作為蛋白沉淀劑，破壞血清中的蛋白質(zhì)結構，釋放出結合態(tài)的脂溶性維生素。
- 渦旋與離心：將 EP 管置于渦旋混勻儀上，以 2500rpm 的轉速渦旋 5min，確保樣本與試劑充分混合；隨后轉移至高速離心機，在 4℃低溫環(huán)境下以 14000rpm 轉速離心 5min，實現(xiàn)固液分離，去除蛋白質(zhì)沉淀等雜質(zhì)。
- 氮吹與復溶：吸取 500μL 離心后的上清液至 96 孔板中，置于 40℃氮吹儀下吹干，去除有機溶劑；向吹干的 96 孔板中加入 100μL 復溶液（50% 乙腈水溶液），放入微孔板震蕩儀以 2000rpm 轉速震搖 2min，使目標化合物充分溶解；最后以 4000rpm 轉速離心 5min，取上清液作為進樣樣品，進樣體積為 10μL 或 20μL。
為實現(xiàn)五種脂溶性維生素的有效分離，實驗選用 Phenomenex Kinetex F5 Column（3.0mm×50mm，2.6μm）色譜柱，該色譜柱具有優(yōu)異的疏水選擇性與分離效率。具體色譜條件設置如下：
- 流動相：流動相 A 為含 0.1% 甲酸的水溶液，流動相 B 為含 0.1% 甲酸的甲醇溶液，通過甲酸調(diào)節(jié) pH 值，改善目標化合物的色譜峰形與離子化效率。
- 柱溫：設定為 40℃，穩(wěn)定的柱溫可減少保留時間波動，提高檢測重復性。
- 梯度洗脫：根據(jù) ESI 源與 APCI 源的離子化特性，采用不同的梯度洗脫程序（見表 1）。ESI 源梯度洗脫中，初始流速為 0.4mL/min，A 相占比 30%、B 相占比 70%，隨時間逐步調(diào)整至 B 相 100% 并保持，最終恢復初始比例平衡色譜柱；APCI 源梯度洗脫初始流速為 0.6mL/min，A 相 50%、B 相 50%，同樣通過梯度調(diào)整實現(xiàn)目標化合物的分離。
質(zhì)譜檢測采用多反應監(jiān)測模式（MRM），可特異性篩選目標離子，提高檢測靈敏度與抗干擾能力，具體參數(shù)如下：
- 離子化模式：同時支持 ESI+（正離子模式）與 APCI+（正離子模式），離子源溫度均設定為 500℃，噴霧電壓 5000V，氣簾氣 10psi。其中，ESI 源霧化氣 50psi、輔助加熱氣 55psi，APCI 源霧化氣 20psi、無輔助加熱氣；碰撞氣壓力為 2，入口電位（EP）7.5V，碰撞室出口電位（CXP）2V。
- 離子對參數(shù)：每種目標化合物均設定定量離子對與定性離子對，內(nèi)標化合物（如 VA-d6、25OHVD2-d3、25OHVD3-d6 等）用于校正基質(zhì)效應與儀器漂移（見表 2）。例如，VA 的定量離子對為 269.1→93.1（ESI 源），定性離子對為 269.1→119.3，駐留時間 20ms，去簇電壓（DP）50V，碰撞能量（CE）分別為 50V 與 15V；VK1 在 APCI 源下的定量離子對為 451.4→187.1，DP 110V，CE 20V。
五種脂溶性維生素在真實樣本中的提取離子圖（XIC）顯示，各化合物峰形對稱、分離度良好，無明顯干擾峰（見圖 1）。同一血清樣本分別經(jīng) ESI 源與 APCI 源檢測，保留時間穩(wěn)定：ESI 源下，VA 保留時間 2.843min、25OHVD2 2.760min、25OHVD3 2.718min、VE 4.110min、VK1 4.152min；APCI 源下，各化合物保留時間略有差異（如 VA 2.449min、VK1 4.459min），但均滿足定性定量要求。
以目標化合物濃度為橫坐標（x，ng/mL），峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y），采用權重 1/x2 進行線性回歸，結果顯示（見表 3）：
- 五種脂溶性維生素的線性范圍覆蓋臨床常見濃度區(qū)間，如 25OHVD2 為 1-50ng/mL、25OHVD3 為 1-100ng/mL、VK1 為 0.1-5ng/mL。
- 所有化合物的相關系數(shù) r2 均大于 0.99，其中 VA（ESI 源）r2=0.9997、25OHVD3（APCI 源）r2=0.9996，表明方法線性關系優(yōu)異，可準確量化不同濃度水平的目標化合物。
精密度以相對標準偏差（RSD%）評價，準確度以加標回收率評價，檢測低濃度（線性范圍下限 3 倍）與高濃度（線性范圍上限 70%）樣本，結果如下（見表 3）：
- 精密度：除 ESI 源檢測 VK1 低濃度時 RSD% 為 17.9% 外，其余情況下低濃度與高濃度樣本的 RSD% 均小于 10%。例如，25OHVD3（ESI 源）低濃度 RSD%=5.5%、高濃度 3.9%；VE（APCI 源）低濃度 9.1%、高濃度 5.9%，表明方法重復性良好。
- 準確度：所有化合物的加標回收率在 90.5%-105.6% 之間，如 25OHVD2（APCI 源）低濃度回收率 105.1%、高濃度 100.0%；VA（ESI 源）低濃度 102.9%、高濃度 99.2%，符合臨床檢測對準確度的要求。
- 雙離子源兼容：無需切換 ESI 源與 APCI 源，即可完成不同脂溶性維生素的檢測，簡化操作流程，提高檢測效率。
- 優(yōu)異的檢測性能：方法線性關系好（r2>0.99）、精密度高（多數(shù) RSD%<10%）、準確度佳（回收率 90.5%-105.6%），可滿足臨床精準檢測需求。
- 臨床適用性強：覆蓋臨床常見脂溶性維生素種類，檢測范圍適配人體生理濃度，為維生素缺乏癥的早期診斷、營養(yǎng)狀況評估及個性化補充指導提供可靠的技術支持。
綜上，該方法為臨床實驗室開展脂溶性維生素檢測提供了高效、精準的解決方案，有望在婦幼保健、老年醫(yī)學、慢性病管理等領域廣泛應用，助力提升人體營養(yǎng)健康監(jiān)測水平。
