安益譜 Anyeep TQ9100 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)三種氯霉素藥物方案（參考 GB/T 22959-2008）
一、方案背景與意義
氯霉素類(lèi)藥物是一類(lèi)廣譜抗生素，常用的包括氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FF），曾廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病。然而，此類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，易在肌肉、肝臟、腎臟等組織中殘留，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后，可能引發(fā)再生障礙性貧血、灰嬰綜合征等嚴(yán)重健康問(wèn)題，還可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，威脅公共衛(wèi)生安全。
我國(guó)《GB/T 22959 - 2008 河豚魚(yú)、鰻魚(yú)和烤鰻中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法》明確規(guī)定了水產(chǎn)品中這三種氯霉素類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法與限量要求。安益譜 Anyeep TQ9100 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，憑借超高效液相色譜的快速高效分離能力與三重四極桿質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，結(jié)合外標(biāo)法定量，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中三種氯霉素藥物的精準(zhǔn)檢出與定量，為食品安全監(jiān)管、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)提供可靠技術(shù)支撐，保障消費(fèi)者健康。
安益譜TQ9100三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀
二、儀器設(shè)備與試劑材料
（一）核心儀器配置
- 超高效液相色譜部分：配備二元高壓梯度泵，流速范圍 0.001 - 5.000mL/min，流速精度優(yōu)于 ±0.075% RSD，能精準(zhǔn)控制流動(dòng)相比例，實(shí)現(xiàn)三種氯霉素藥物的高效分離；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣體積范圍 0.1 - 100μL，進(jìn)樣精度≤0.5% RSD，支持高通量樣品分析，減少人為誤差；柱溫箱控溫范圍 4 - 80℃，控溫精度 ±0.1℃，可通過(guò)穩(wěn)定柱溫提升色譜分離重復(fù)性。適配 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1×100mm，1.7μm），該色譜柱具有高柱效、高選擇性，能有效分離結(jié)構(gòu)相似的三種氯霉素藥物。
- 三重四極桿質(zhì)譜部分：采用電噴霧離子源（ESI），可根據(jù)氯霉素類(lèi)藥物特性選擇負(fù)離子模式，離子源溫度 350℃，毛細(xì)管電壓 3.5kV，確保目標(biāo)物高效離子化；三重四極桿質(zhì)量分析器質(zhì)量范圍 5 - 2000m/z，掃描速度高達(dá) 20000Da/s，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，能精準(zhǔn)捕捉三種氯霉素藥物的特征母離子與子離子，有效排除基質(zhì)干擾，檢出限（LOD）可達(dá) 0.01μg/kg 級(jí)別。
- 數(shù)據(jù)系統(tǒng)：搭載 ANYEEP LC - MS 工作站，集成儀器控制、數(shù)據(jù)采集、譜圖解析、外標(biāo)法定量計(jì)算等功能。軟件支持自動(dòng)峰識(shí)別、積分，可快速繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中目標(biāo)物含量，操作便捷，數(shù)據(jù)處理高效準(zhǔn)確，同時(shí)支持與實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）對(duì)接，便于數(shù)據(jù)管理與追溯。
- 固相萃取裝置：配備 12 位真空固相萃取儀，可同時(shí)處理多個(gè)樣品，提高前處理效率。適配 Oasis HLB 固相萃取小柱（60mg/3mL），用于樣品提取液中三種氯霉素藥物的富集與凈化，去除雜質(zhì)干擾，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。
- 氮吹儀：采用恒溫水浴加熱，控溫范圍室溫 - 99℃，控溫精度 ±1℃，通過(guò)氮?dú)獯祾邔?shí)現(xiàn)樣品溶液的快速濃縮，滿足儀器進(jìn)樣要求，且能有效避免目標(biāo)物損失。
- 渦旋振蕩器：用于樣品與試劑的快速混合，加速提取過(guò)程，提高目標(biāo)物提取效率。
- 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速范圍 0 - 15000r/min，用于樣品提取后的離心分離，實(shí)現(xiàn)提取液與樣品殘?jiān)姆蛛x，便于后續(xù)凈化操作。
（二）試劑與耗材
- 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FF）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；三種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度 100μg/mL，溶劑為甲醇），用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
- 有機(jī)溶劑：甲醇、乙腈（均為色譜純），用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品提取及作為液相色譜流動(dòng)相；乙酸銨（色譜純），用于配制流動(dòng)相緩沖液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相 pH 值，改善目標(biāo)物分離效果與離子化效率；甲酸（質(zhì)譜純），用于優(yōu)化離子源條件，提升目標(biāo)物離子化效率。
- 固相萃取耗材：Oasis HLB 固相萃取小柱（60mg/3mL），使用前需用甲醇、水活化；一次性注射器（5mL）、針頭過(guò)濾器（0.22μm 有機(jī)相），用于樣品溶液的過(guò)濾與轉(zhuǎn)移，防止雜質(zhì)進(jìn)入儀器。
- 其他耗材：具塞離心管（50mL、10mL）、容量瓶（10mL、50mL、100mL）、移液槍?zhuān)?0 - 1000μL）及配套槍頭，用于樣品前處理與溶液配制，所有耗材均需經(jīng)嚴(yán)格清洗、烘干，避免引入污染。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）樣品采集與保存（參考 GB/T 22959-2008）
- 樣品采集：選取具有代表性的樣品（如河豚魚(yú)、鰻魚(yú)、烤鰻等水產(chǎn)品），采用四分法取樣，將樣品切碎后用組織搗碎機(jī)充分勻漿，裝入潔凈的聚乙烯樣品瓶中。
- 樣品保存：將勻漿后的樣品置于 - 20℃冷凍保存，保存時(shí)間不超過(guò) 7d，避免樣品變質(zhì)或目標(biāo)物降解，運(yùn)輸過(guò)程中需保持低溫環(huán)境。
（二）樣品前處理
- 樣品提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取 5.00g 勻漿樣品于 50mL 具塞離心管中，加入 10mL 乙腈，渦旋振蕩 5min，使樣品與提取溶劑充分混合，隨后超聲提取 15min，加速目標(biāo)物從樣品基質(zhì)中溶出。
- 離心分離：將提取后的樣品在 8000r/min 條件下離心 10min，使提取液與樣品殘?jiān)蛛x，小心吸取上清液至另一潔凈離心管中。
- 固相萃取凈化
- 小柱活化：將 Oasis HLB 固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，依次用 5mL 甲醇、5mL 水活化小柱，流速控制在 1 - 2mL/min，確保小柱填料充分溶脹，去除柱內(nèi)雜質(zhì)。
- 上樣與淋洗：將離心后的上清液緩慢上樣至活化后的固相萃取小柱，待液體完全流出后，用 5mL 水淋洗小柱，去除水溶性雜質(zhì)，然后在負(fù)壓條件下抽干小柱 3 - 5min。
- 目標(biāo)物洗脫：用 5mL 甲醇分兩次洗脫小柱，收集洗脫液于 10mL 具塞離心管中。
- 濃縮定容：將洗脫液置于氮吹儀上，在 40℃水浴條件下，用氮?dú)獯祾邼饪s至近干，然后用甲醇 - 水（1:1，v/v）混合溶液定容至 1mL，過(guò) 0.22μm 有機(jī)相針頭過(guò)濾器，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，待儀器分析。
（三）儀器分析條件
- 超高效液相色譜條件
- 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）。
- 流動(dòng)相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液（含 5mmol/L 乙酸銨），B 相為乙腈；采用梯度洗脫程序：0 - 2min，10% B；2 - 5min，10% - 40% B；5 - 8min，40% - 90% B；8 - 10min，90% B；10 - 11min，90% - 10% B；11 - 15min，10% B。流速 0.3mL/min。
- 柱溫：35℃。
- 進(jìn)樣量：5μL。
- 三重四極桿質(zhì)譜條件
- 離子源：ESI 負(fù)離子模式。
- 離子源溫度：350℃。
- 毛細(xì)管電壓：3.5kV。
- 錐孔電壓：30V。
- 碰撞氣：氬氣，壓力 2.0×10?3mbar。
- 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），三種氯霉素藥物的特征離子對(duì)及碰撞能量如下：氯霉素（CAP）母離子 m/z 321，子離子 m/z 152（碰撞能量 25eV）、m/z 257（碰撞能量 15eV）；甲砜霉素（TAP）母離子 m/z 355，子離子 m/z 186（碰撞能量 28eV）、m/z 291（碰撞能量 18eV）；氟苯尼考（FF）母離子 m/z 357，子離子 m/z 188（碰撞能量 30eV）、m/z 293（碰撞能量 20eV）（具體參數(shù)可根據(jù)儀器調(diào)試結(jié)果優(yōu)化）。
（四）外標(biāo)法定量分析
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取三種氯霉素藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL），用甲醇 - 水（1:1，v/v）混合溶液逐步稀釋?zhuān)苽錆舛葹?0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照上述儀器分析條件，由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，記錄各濃度下三種目標(biāo)物的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制三種氯霉素藥物的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求相關(guān)系數(shù) R2≥0.995。
- 樣品檢測(cè)：將處理好的樣品溶液進(jìn)樣分析，記錄三種氯霉素藥物的保留時(shí)間與峰面積。根據(jù)外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中三種氯霉素藥物的含量。若樣品濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，需用甲醇 - 水（1:1，v/v）混合溶液稀釋后重新測(cè)定。
四、方法驗(yàn)證與性能指標(biāo)
（一）線性范圍與相關(guān)系數(shù)
對(duì)三種氯霉素藥物的 0.1 - 50ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FF）在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) R2 均≥0.998，表明外標(biāo)法定量在該線性區(qū)間內(nèi)準(zhǔn)確性高，可滿足不同濃度水平樣品的檢測(cè)需求。
（二）檢出限與定量限
以 3 倍信噪比（S/N = 3）計(jì)算檢出限（LOD），10 倍信噪比（S/N = 10）計(jì)算定量限（LOQ）。經(jīng)測(cè)定，三種氯霉素藥物的 LOD 均為 0.01μg/kg，LOQ 均為 0.03μg/kg，遠(yuǎn)低于 GB/T 22959 - 2008 標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量要求（如水產(chǎn)品中氯霉素殘留限量為不得檢出，甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩粝蘖客ǔ?0.1μg/kg），充分體現(xiàn)了 Anyeep TQ9100 儀器對(duì)氯霉素類(lèi)藥物的高靈敏度檢測(cè)能力。
（三）精密度與準(zhǔn)確度
- 精密度：取濃度為 1ng/mL 的三種氯霉素藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，計(jì)算保留時(shí)間與峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，三種藥物保留時(shí)間 RSD 均＜0.5%，峰面積 RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好，方法重復(fù)性高。
- 準(zhǔn)確度：對(duì)空白樣品（如未添加氯霉素類(lèi)藥物的鰻魚(yú)樣品）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加低、中、高三個(gè)濃度水平（0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg）的三種氯霉素藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定 6 次。計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果顯示，三種藥物的加標(biāo)回收率均在 85% - 115% 之間，符合 GB/T 22959 - 2008 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)準(zhǔn)確度的要求，說(shuō)明該方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中可靠性強(qiáng)，無(wú)明顯系統(tǒng)誤差。
五、注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制
- 樣品前處理質(zhì)量控制：每批次樣品處理過(guò)程中，需同步進(jìn)行空白樣品、平行樣品及加標(biāo)回收樣品分析。空白樣品中目標(biāo)物含量應(yīng)低于檢出限，平行樣品相對(duì)偏差應(yīng)≤10%，加標(biāo)回收率需在 85% - 115% 范圍內(nèi)，否則需重新實(shí)驗(yàn)；固相萃取小柱每批次使用前需進(jìn)行空白檢測(cè)，確保無(wú)目標(biāo)物污染。
- 儀器維護(hù)與校準(zhǔn)：定期檢查液相色譜泵的密封性、流速準(zhǔn)確性，清洗進(jìn)樣針與流路系統(tǒng)，防止堵塞與污染；每周對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行調(diào)諧，確保儀器靈敏度、分辨率等性能指標(biāo)處于最佳狀態(tài)；每月用標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性。
- 數(shù)據(jù)審核：定性分析時(shí)，目標(biāo)物保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品偏差應(yīng)≤0.1min，且特征離子對(duì)的相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品偏差應(yīng)≤20%；定量分析時(shí)，若樣品濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，需重新稀釋樣品測(cè)定，并準(zhǔn)確記錄稀釋倍數(shù)；檢測(cè)數(shù)據(jù)需進(jìn)行雙人復(fù)核，避免數(shù)據(jù)錄入錯(cuò)誤。
六、方案優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用場(chǎng)景
（一）方案優(yōu)勢(shì)
- 高靈敏度與選擇性：Anyeep TQ9100 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的 MRM 掃描模式結(jié)合優(yōu)化的儀器參數(shù)，能有效排除樣品復(fù)雜基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種氯霉素藥物的高靈敏度檢測(cè)，即使在痕量水平下也能準(zhǔn)確測(cè)定，滿足嚴(yán)格的限量要求。
- 高效快速：超高效液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的快速掃描功能結(jié)合，可在 15min 內(nèi)完成一針樣品分析，大幅縮短檢測(cè)時(shí)間；外標(biāo)法定量操作簡(jiǎn)便，無(wú)需內(nèi)標(biāo)物，降低實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)保證定量準(zhǔn)確性。
- 貼合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范：方法嚴(yán)格遵循 GB/T 22959 - 2008 標(biāo)準(zhǔn)要求，從樣品前處理到儀器分析、數(shù)據(jù)處理，各個(gè)環(huán)節(jié)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，檢測(cè)數(shù)據(jù)可直接用于食品安全監(jiān)管、產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)等官方場(chǎng)合。
（二）應(yīng)用場(chǎng)景
- 水產(chǎn)品檢測(cè)：用于河豚魚(yú)、鰻魚(yú)、烤鰻、蝦、蟹等水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康臋z測(cè)，保障水產(chǎn)品食用安全。
- 畜禽產(chǎn)品檢測(cè)：適用于雞肉、豬肉、牛肉、雞蛋等畜禽產(chǎn)品中氯霉素類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)，監(jiān)督畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中藥物的合理使用。
- 食品監(jiān)管與抽檢：為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持，用于食品抽檢、風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不合格產(chǎn)品，防范食品安全風(fēng)險(xiǎn)。
